干细胞治疗卵巢早衰的研究进展

左侠,陈蕾△
2019-03-30

作者单位:100048 北京,中国人民解放军海军总医院妇产科(左侠,陈蕾);第四军医大学(左侠)通信作者:陈蕾,E-mail:chenleis@mail.tsinghua.edu.cn

△审校者


【摘 要】 卵巢早衰(POF)是由多种病因导致的卵泡功能衰竭。大约 80%患者属于特发 性POF。POF 治疗棘手,近年国内外取得了应用干细胞恢复卵巢功能及生育力等方面的动物试验成果,为 POF 患者卵巢功能及生育功能的恢复带来了希望。干细胞包括胚胎干细胞和成体干细胞,胚胎干细胞治疗因其引起伦理争议而受到限制。目前成体干细胞治疗包括生殖干细胞、骨髓间充质干细胞和胎儿间充质干细胞的治疗。干细胞可能通过分化为卵母细胞或通过旁分泌抑制卵泡凋亡来修复受损卵巢。现对 POF 的干细胞治疗进展进行综述。


【关键词】 卵巢功能早衰;干细胞;胚胎干细胞;成体干细胞


卵巢早衰(POF)是指女性在 40 岁以前出现持续性闭经、性器官萎缩,伴有促性腺激素包括卵泡刺激素(FSH)和黄体生成激素(LH)升高,而雌激素降低的综合征。在国外,普通人群POF 发病率约为 1%[1],中国约 3.8%,其中特发性 POF 约占 80%[2]。对于POF患者来说,现有的临床治疗主要为激素替代治疗(HRT)。HRT 能缓解更年期症状及远期并发症,但长期 HRT 有增加乳腺癌、心脏病和中风风险的担忧[3]。目前尚无明确有效的治疗措施恢复卵巢功能。近 10年来,干细胞治疗在动物试验方面取得的成果为POF 患者卵巢功能及生育能力的恢复带来了希望。现就干细胞治疗 POF 的研究进展综述如下。

1. 干细胞的发现、分类及治疗作用

干细胞是一类具有多向分化潜能和自我复制能力的原始未分化细胞,是形成哺乳类动物的各组织器官的原始细胞。干细胞研究开始于 20 世纪 60 年代 , 在 加 拿 大 科 学 家 James E. Till 和 Ernest A.McCulloch 发现并命名造血干细胞之后。1970 年Martin Evans 从小鼠中分离出胚胎干细胞并在体外进行培养,其能分化出成体动物的所有组织和器官,包括生殖细胞。在 1998 年末,美国两个研究小组成功培养出人类胚胎干细胞,保持了胚胎干细胞分化为各种体细胞的全能性。造血干细胞是最早被发现的,且研究最多、最先用于治疗疾病的成体干细胞,长期以来,一直认为干细胞只属于造血系统。随着干细胞研究的不断深入,近年来,几乎在所有组织中都发现了干细胞,干细胞生物学和干细胞生物工程已成为继人类基因组大规模测序之后最具活力、最有影响和最有应用前景的生命学科。

干细胞按发育阶段分为两大类:胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞取自囊胚里的内细胞团,而成体干细胞则来自各式各样的组织。目前发现,心脏、胰腺、肝脏、神经、皮肤、牙齿、头发、骨髓、卵巢等器官和组织中都存在干细胞,卵巢中干细胞的发现尤其是生殖干细胞的发现为延缓衰老及 POF 的治疗提供了良好的前景。干细胞具有增殖和分化能力,凡需要不断产生新的分化细胞以及分化细胞本身不能再分裂的细胞或组织,都要通过干细胞所产生的具有分化能力的细胞来维持机体细胞的数量,可以说,生命是通过干细胞的分裂来实现细胞的更新及持续生长的。目前干细胞移植已经用于多种脏器疾病的研究,但除了造血干细胞治疗血液病技术已非常成熟之外,其他干细胞技术尚处于临床试验阶段。干细胞治疗疾病的原理为:①修复损伤的组织细胞。②替代损伤细胞的功能。③刺激机体自身细胞的再生功能。

2. POF 干细胞的发现及研究成果

POF 是由多种原因造成的卵泡功能衰竭,与卵泡闭锁增加有关。卵泡功能的恢复依赖于生殖细胞的再生或卵泡闭锁速度的减慢。干细胞的增殖分化能力使其恢复卵泡功能成为可能。现已发现胚胎干细胞、部分成体干细胞可以向生殖细胞分化,并在动物实验中证实了恢复卵巢功能及生育能力的效果。

2.1 POF 干细胞的发现

Johnson 等[4]发现生殖细胞是不断变化的,打破了生殖细胞只减少不增加的传统观念,确立了出生后生殖细胞是处于动态平衡中的观念。Bukovsky 等[5]发现绝经后妇女卵巢上皮层存在卵母细胞样细胞。Virant-Klun 等[6]证实,这种细胞小而圆,具有多种潜能,呈现胚胎干细胞的潜质和体外分化为卵母细胞样细胞。进一步研究发现,特发性POF 患者卵巢上皮组织中也存在多潜能干细胞[7],从而证实卵巢上皮层存在生殖干细胞。2009 年 Zou 等[8]首次从小鼠卵巢中分离出雌性生殖干细胞。除了生殖干细胞外,有部分成体干细胞如骨髓干细胞[9]、猪胎仔皮肤干细胞[10]和大鼠胰腺干细胞[11]具有向生殖细胞分化的潜能,也有可能引起卵泡的更新。也有研究发现,在一些癌症幸存患者中,其卵巢功能和生育能力在骨髓移植后恢复并分娩正常健康后代。这提示干细胞移植后可能向卵母细胞分化,或修复损伤的卵巢而恢复功能。

胚胎干细胞可以分化为所有组织和器官,包括生殖细胞,但胚胎干细胞来源困难,涉及伦理问题,从而限制了胚胎干细胞在 POF 治疗中的研究。但Takahashi 等[13]首次报道,通过特定的转录因子把小鼠成纤维细胞重新编程为具有胚胎干细胞多能性的细胞———iPS 细胞。iPS 细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似。周琪和曾凡领导的研究小组[14]及高绍荣研究小组[15]分别采用逆转录病毒和慢病毒转染的方法,利用 iPS 细胞通过四倍体囊胚注射得到存活并具有繁殖能力的小鼠,在世界上首次证明了 iPS 细胞的全能性。Kang 等[16]将鼠诱导性多能干细胞与卵巢颗粒细胞共培养,发现表达卵泡刺激素受体(FSHR)的颗粒细胞超过90%,共培养组雌二醇(E2

)浓度明显增加,且在 7 d 内随时间延长而增加。Zhang 等[17]将 iPS 细胞和胚胎干细胞与颗粒细胞在体外共培养,结果发现,共培养组 E2 水平随时间升高,骨形态发生蛋白 15(BMP-15)、FSHR、抑制素 α 亚基(INHA)、抗苗勒管激素(AMH)、新生儿卵巢同源基因盒(NOBOX)及生长分化因子-9(GDF-9)基因水平显著上调。这些研究提示,iPS 细胞与颗粒细胞共培养能通过间接的细胞间作用有效诱导为颗粒细胞样细胞,使得应用 iPS细胞治疗 POF 成为可能。

2.2 干细胞治疗 POF 的成果

因胚胎干细胞伦理争议及来源困难,其用于 POF 研究受到限制。iPS 细胞需要借助病毒载体导入基因,故效率低、具有成瘤性,尚未出现用于 POF 治疗的活体试验。目前用于POF 治疗研究的干细胞主要为成体干细胞,包括生殖干细胞、骨髓间充质干细胞和胎儿间充质干细胞。

2.2.1 生殖干细胞治疗

生殖干细胞治疗是将分离提纯的雌性生殖干细胞通过体外扩增培养后移植入受损卵巢内,通过卵母细胞再生修复恢复卵巢功能及生育能力。目前生殖干细胞移植治疗 POF 仍然处于动物试验阶段,主要有两大成果:①2009 年 Zou 等[8]在幼年小鼠及成年小鼠卵巢中分离出雌性生殖干细胞,并发现这些细胞能在体外稳定生长数月,将这些细胞移植入经化疗药物诱导的不孕小鼠卵巢中,能分化成新的卵母细胞,并且能发育成熟,与雄性交配后还出生了正常后代。2012 年 White 等[18]从健康的育龄妇女卵巢皮质中分离出生殖干细胞,在体外增殖后进行绿色荧光蛋白标记,移植入免疫缺陷小鼠卵巢中,移植 7 d 后能产生卵母细胞。这两大发现使应用生殖干细胞移植来调节卵巢功能和生育能力成为可能。但是生殖干细胞要应用于临床研究仍然存在困难。首先需要相当量的产卵母细胞的干细胞在生育年龄妇女的卵巢中存在,而目前能够分离出的卵巢源性干细胞非常有限,代价昂贵。有研究发现,来源于出生后小鼠卵巢的表达 Ddx4 的细胞不能进入有丝分裂,在卵泡重新形成中也不能贡献卵母细胞[19]。证明哺乳动物出生后卵巢中没有卵泡更新,没有有丝分裂活跃的表达 Ddx4 的雌性生殖系祖细胞存在。这种结果与 Zou 等[8]及 White 等[18]的研究结果相矛盾。这对卵巢功能的恢复提出了挑战,因此需要更多的研究去验证分离卵巢源性干细胞及其移植后效果。

2.2.2 骨髓间充质干细胞治疗

骨髓间充质干细胞是存在于骨髓中的间充质干细胞,具有定向或多向分化的潜能,可以分化为骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞等,还能分泌许多与细胞生长发育相关的因子。骨髓间充质干细胞最基本的功能是支持造血,但近年来许多研究发现,骨髓间充质干细胞对神经、心肌、肝、肺、肾等多种器官和组织的损伤具有修复功能。

①治疗机制:骨髓间充质干细胞离体培养,可自发分化为性类固醇激素生成细胞,在体可引起成年卵母细胞及卵泡更新。Fu 等[20]研究发现,骨髓间充质干细胞体外培养能分泌血管上皮生长因子、胰岛素样生长因子 1 和干细胞生长因子,将其与卵巢颗粒细胞体外共培养能够抑制颗粒细胞凋亡。将其移植入环磷酰胺诱导的 POF 模型大鼠卵巢中,能升高E2,减少颗粒细胞凋亡,上调 Bcl-2 水平。由此推论,骨髓间充质干细胞一方面可以通过分化为卵母细胞或性激素生成细胞来引起卵泡更新,另一方面可以通过其旁分泌功能抑制卵泡凋亡来发挥作用。但具体机制需要进一步证实。

②治疗成果:近 5 年来,骨髓间充质干细胞已证实其恢复卵巢功能及生育能力的优势。2007 年,Lee将绿色荧光蛋白(GFP)标记的转基因雌鼠的骨髓移植至受体雌鼠,可见来自于供体移植细胞所产生的GFP(+)标记的卵母细胞以及其外围由受体颗粒细胞包绕形成的原始卵泡,但受体鼠怀孕后产下的子代是受体鼠生殖细胞来源。证实骨髓来源的生殖细胞可引起成年卵巢卵母细胞和卵泡更新,修复化疗诱导的 POF 模型小鼠的长期生育能力。2012 年Ghadami 等[21]通过给 FORKO 小鼠静脉移植骨髓间充质干细胞,发现能够到达小鼠卵巢,并分化和表达FSHR 基因,使 FSHR 对 FSH 有反应,恢复卵泡成熟和类固醇激素产生,使血 FSH 降低 40%~50%,E2 升高 4~5.5 倍,但未发现排卵及妊娠。恢复卵巢功能的机制考虑可能系这些移植细胞分化或与卵巢局部细胞融合将自己的基因及细胞成分贡献给这些细胞而起作用,但具体机制需进一步研究证实。这些研究证实,骨髓间充质干细胞能影响卵巢功能,且可能恢复生育能力。

总之,骨髓间充质干细胞体内来源丰富,体外培养及移植技术成熟,可进行自体移植而排除免疫排斥反应并易被患者接受,不存在伦理道德问题,具有优越性,但其治疗效果及作用机制需进一步研究证实。

2.2.3 胎儿间充质干细胞治疗

近年来,间充质干细胞已经在妊娠期或出生后从胎儿组织中分离出来,包括脐带华通胶间充质干细胞、脐血间充质干细胞、羊水间充质干细胞、羊膜间充质干细胞和胎盘间充质干细胞,都具有干细胞多分化潜能,且能非侵入性大量获得并避免胚胎研究的伦理问题,具有一定优势。

Huang 等[22]研究发现,人类脐带华通胶间充质干细胞体外培养能形成生殖细胞。李彩霞等[23]将脐带间充质干细胞经尾静脉移植入环磷酰胺造成的 POF小鼠体内,结果发现其可向卵巢归巢并在卵巢内存活生长,说明其可能具有卵巢损伤修复作用。Liu 等[24]将体外培养扩增的红色荧光蛋白转导的 CD44+/CD105+羊水间充质干细胞移植入环磷酰胺诱导的POF 小鼠卵巢内 3 周,仍可探测到标记细胞,并证实标记细胞可正常扩增及自我更新。党建红等[25]研究发现,脐血间充质干细胞移植入放疗引起 POF 的裸鼠卵巢内可使 E2 上升及 FSH 和 LH 下降,未闭锁卵泡数增加并可见各个发育阶段卵泡。胎儿间充质干细胞移植可能引起卵巢功能的改善,但其取自孕产妇,需要做好知情同意工作,相对获取途径较窄,使其应用受到限制。

3 .展望

POF 病因复杂,治疗困难。目前临床治疗主要集中在缓解更年期症状及辅助生殖治疗。干细胞治疗的发现及近些年在动物实验中所取得的成果使卵巢功能及生育能力的恢复成为可能。胚胎干细胞涉及伦理学问题,其研究受到一定限制。胎儿间充质干细胞获得途径受到限制。生殖干细胞分离提纯技术尚处于试验阶段,需要进一步探索和验证其功能。骨髓间充质干细胞分离提纯技术及体外培养扩增技术成熟,可自体移植,不存在伦理问题,与其他几种干细胞相比相对具有优势,易于被患者接受。目前干细胞研究尚处于初级阶段,对其修复卵巢机制仍需进一步阐明,其治疗后的长期作用仍需进一步验证。而且目前所选大多为化疗诱导 POF 模型,进一步研究可选择既能代表卵泡衰竭又能代表卵泡功能障碍的模型进行干细胞移植研究,为广大的特发性 POF 患者卵巢功能的恢复开发一条崭新途径。


国际妇产科学杂志 2014 年 2 月第 41 卷第 1 期

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